Phát hiện vi khuẩn Alicyclobacillus trong đồ uống

16/03/2016

Những điểm đáng lưu ý: Vi khuẩn hình thành bào tử gram dương, ưa nhiệt, ưa acid và không gây bệnh, có khả năng sinh trưởng trong nhiều điều kiện nhiệt độ cũng như pH, có thể làm đồ uống mất hết hương vị, gây hư hỏng có thể không rõ ràng như không có khí nào được sinh ra.

Khái quát về vi khuẩn Alicyclobacillus

Alicyclobacillus là một loại vi khuẩn hiếm thấy và mang trong mình hiểm họa tiềm tàng đối với ngành công nghiệp sản xuất đồ uống. Cho tới những nghiên cứu gần đây, mới chỉ có nấm men, nấm mốc và một số vi khuẩn axit-lactic được coi là có khả năng làm hỏng đồ uống bao gồm cả sinh tố trái cây, dựa trên độ pH thấp của chúng. Nhưng tại Đức vào năm 1984, một lượng lớn nước sinh tố táo được phát hiện là đã bị hỏng trong điều kiện đóng gói vô trùng bởi 1 loại vi khuẩn kháng nhiệt. Đây là trường hợp đồ uống bị hư hỏng do vi khuẩn đầu tiên được ghi nhận mà sau này được biết đến dưới cái tên Alicyclobacillus. Kể từ đó, những trường hợp hư hỏng tương tự cũng bắt đầu được ghi nhận ở khắp nơi trên thế giới. Vi khuẩn này có thể trở thành mối quan ngại to lớn bởi một số chủng vi khuẩn có thể gây ra những phản ứng hóa học đặc biệt với cường độ mạnh trong đồ uống trái cây. Các biến đổi này rất khó để kiểm soát nếu phát sinh trong môi trường xử lý. Sự xuất hiện của những phép thử có tính chính xác cao là vô cùng quan trọng cho hoạt động theo dõi quá trình sản xuất cũng như hoàn thiện sản phẩm, qua đó đảm bảo thành phẩm không có vi khuẩn Alicyclobacillus. Một số giải pháp được phát triển dựa trên những công nghệ nhanh và truyền thống nhằm giải quyết vấn đề này.

Alicyclobacillus là loài vi khuẩn hình thành bào tử Gram dương, ưa nhiệt, ưa chua và không gây bệnh được tìm thấy trong các mạch nước nóng chứa axit và trong dầu
Vi khuẩn Alicyclobacillus

Lịch sử

Vi khuẩn hình thành bào tử có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao và độ pH thấp lần đầu tiên được phân lập từ một suối nước nóng Nhật Bản vào năm 1967. Những loại vi khuẩn ưa nhiệt và ưa chua này ban đầu được phân loại như Bacillus coagulans nhưng sau đó sự phân lập tương tự từ 1 mạch nước nóng miệng núi lửa của Mỹ được phân loại như 1 loại vi khuẩn mới và được đặt tên là Bacillus acidocaldarius. Sau đó, rất nhiều những loại vi khuẩn khác tương tự cũng được phát hiện, trong đó bao gồm chủng loại vi khuẩn từng xuất hiện trong sản phẩm nước sinh tố táo tại Đức được đặt tên là Bacillus acidoterrestris. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn sau này đã chỉ ra rằng những vi khuẩn này thực chất tồn tại những điểm khác biệt đối với các loại Bacillus khác và đến năm 1992, chi Alicyclobacillus đã được đề xuất. Tính đến nay, khoảng 20 loại Alicylcobacillus đã được xác định.

Vi trùng học

Alicyclobacillus là loài vi khuẩn hình thành bào tử Gram dương, ưa nhiệt, ưa chua và không gây bệnh được tìm thấy trong các mạch nước nóng chứa axit và trong dầu. Chúng hiếu khí và phát triển trên diện rộng ở nhiệt độ từ 4 – 70oC và độ pH từ và từ 0.5 – 6.5, mặc dù được phân lập từ nước uống trái cây hỏng và thường không tồn tại trong điều kiện nhiệt độ thấp hoặc axit cao. Các bào tử có tính chịu nhiệt và có khả năng sống sót ngay cả khi trải qua phương pháp khử trùng Pasteur thường áp dụng cho nước ép hoa quả và những đồ uống có thời hạn sử dụng ổn định khác. Người ta cho rằng chính sự sốc nhiệt của phương pháp khử trùng Pasteur đã thúc đẩy quá trình sinh sôi của bào tử. Khả năng phát triển của loại vi khuẩn này trong môi trường có tính axit như nước trái cây lý giải cho việc số lượng của chúng có thể đạt tới cấp số nhân khi sản phẩm đi tới quá trình hoàn thiện đóng gói. Mặc dù Alicyclobacillus dường như xuất hiện khá nhiều trong các sản phẩm từ trái cây, có lẽ là 1 loại ô nhiễm nguồn đất, nhưng không phải lúc nào chúng cũng khiến cho sản phẩm bị hư hại. Tuy nhiên, sự xuất hiện của chúng mang đến những hậu quả tiềm tàng cho các nhà sản xuất đồ uống.

Phế phẩm

Những sản phẩm bị hư hỏng khó phát hiện bởi vì không có khí được sinh ra và có thể sẽ không bao giờ bị phát hiện cho đến khi sản phẩm được đưa ra thị trường và nhà sản xuất phải nhận những phản ứng tiêu cực từ khách hàng. Thật không may, chính quá trình phân lập lại làm sản sinh những hợp chất làm hư hỏng thành phẩm như là các chất chuyển hóa thứ cấp và làm xuất hiện mùi vị đặc trưng như chất khử trùng, thuốc hoặc phê-nol. Hợp chất gây hư hỏng được phát hiện nhiều nhất là guaiacol nhưng halophenols và 2.6-dibromophenol 2 cũng được xác định trong đồ uống hư hỏng. Số lượng khuẩn Alicyclobacillus chỉ rơi vào khoảng 104 CFU/ml đã được tìm thấy trong các mẫu và tốc độ tăng trưởng có thể xảy ra ở nhiệt độ môi trường xung quanh. Các loại vi khuẩn phổ biến được phát hiện trong các phế phẩm là A. acidoterrstris, nhưng A.pomorum, A.acidocaldarius và A.cidiphilus cũng có thể làm sản sinh ra các hợp chất gây mất mùi vị và cũng có thể được tìm thấy trong các sản phẩm hỏng trong một vài trường hợp. Cho đến nay, đã có rất nhiều sản phầm đồ uống ghi nhận sự xuất hiện của hiện tượng biến mất hương vị, trong đó bao gồm nước trái cây và các loại đồ uống sinh tố; đồ uống có chứa carbonate, trà đá hòa tan và các đồ uống hương vị trái cây cũng như cà chua đóng hộp.

Các phương pháp dựa trên nuôi cấy

Bản chất sinh trưởng kín đáo của Alicyclobacillus trong đồ uống có thể gây hư hỏng trên quy mô lớn với những ảnh hưởng nghiêm trọng cho các nhà sản xuất đồ uống. Sàng lọc các thành phần, đặc biệt là các loại nước ép trái cây, đối với bào tử Alicyclobacillus đã trở thành một trong những công cụ quan trọng để ngăn ngừa sự hư hỏng. Một điều quan trọng không kém là phải đảm bảo chất lượng đầu ra thông qua việc giám định kỹ càng thành phẩm, qua đó khẳng định quá trình giám sát trước đó hoạt động hiệu quả và tạo cơ sở phát hiện những mối đe dọa tiềm tàng ở các bước xử lý ban đầu. Những yêu cầu này đã thúc đẩy sự phát triển của một loạt các phương pháp dựa trên những kỹ thuật nuôi cấy truyền thống và công nghệ nhanh.

Các phương thức phát hiện

Tốc độ sinh trưởng của các loại vi khuẩn Alicyclobacillus bị giới hạn trong môi trường dạng rắn không chọn lọc thường được sử dụng để xác định tổng số cá thể vi sinh vật tồn tại trong đồ uống và thức ăn. Như acidophiles, chúng cần một môi trường có độ pH thấp (pH≤4.0) để tồn tại. Bên cạnh đó, một số kiểu môi trường khác cũng có thể đáp ứng và/hoặc có khả năng phát triển nhằm mục đích phát hiện hoặc định lượng Alicyclobacillus bao gồm: Orange serum agar (OSA), Acidified potato dextrose agar, K agar, YSG agar và Bacillus acidoterrestris medium (BAT). Các phương pháp khác nhau đã được phát triển dựa trên các môi trường nuôi cấy này, chủ yếu là do ngành công nghiệp sản xuất nước giải khát thực hiện nhằm đảm bảo chất lượng thành phẩm và tạo ra các môi trường thương mại thích hợp có sẵn. Hầu hết những nghiên cứu này đều hướng tới việc phát hiện ra vi khuẩn A.acidoterrestris. Mặc dù vẫn chưa có phương pháp nào được chính thức công nhận trên toàn thế giới nhưng những cố gắng nghiên cứu đã được thực hiện để phát triển các giao thức phương pháp tiêu chuẩn được áp dụng rộng rãi mang tên: Phương pháp số 12 của Liên đoàn quốc tế các nhà sản xuất nước trái cây (IFU – International Federation of Fruit Juice Producers). Phương pháp này bao gồm các quy trình kiểm tra nguyên liệu thô, bao gồm cả xử lý nước, kiểm tra sản phẩm ngay sau khi hoàn thiện và sau khi được đưa ra thị trường để điều tra hư hỏng tiềm tàng.

Nguyên liệu thô

Các bào tử là mối quan tâm lớn nhất trong nguyên liệu thô và phương pháp IFU bao gồm cả phương pháp sốc nhiệt (điển hình là gia tăng nhiệt độ lên đến 80oC trong 10 phút), nhằm đẩy nhanh quá trình sinh trưởng của bào tử. Sau đó, mẫu thử sẽ được đưa trực tiếp vào môi trường thạch BAT hoặc một môi trường thích hợp ở điều kiện nhiệt độ khoảng 45oC trong 3–5 ngày. Bất cứ dấu hiệu xuất hiện nào của khuẩn lạc đều có thể là các loại Alicyclobacillus. Nếu chỉ phát hiện một lượng nhỏ bào tử thì mẫu có thể được làm tăng sinh trong canh thang BAT từ 2-4 ngày tại nhiệt độ 45oC, hoặc trong trường hợp mẫu thử đó có thể lọc được thì sẽ tiến hành lọc màng trước.

Sản phẩm hoàn thiện sau khi xử lý

Một lần nữa phương pháp phát hiện bào tử lại được áp dụng nhưng sau khi áp dụng phương pháp khử trùng Pasteur thì việc sốc nhiệt được cho là không cần thiết. Khi một lượng nhỏ bào tử xuất hiện trong quá trình đóng gói cuối cùng, quá trình lọc màng và tiền ươm tạo sẽ được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 45oC hoặc tăng sinh trong canh thang BAT cũng được khuyến khích trước khi mẫu được đưa vào môi trường rắn.

Sản phẩm hoàn thiện sau chuỗi phân phối

Mẫu thử nghiệm có thể được đưa vào quá trình tiền ươm tạo trong 7 ngày tại điều kiện nhiệt độ 45oC và có thể được áp dụng phương pháp sốc nhiệt cũng như quy trình tăng sinh. Tuy nhiên, nếu như phát hiện bất cứ dấu hiệu nào của việc hư hỏng, tế bào sinh dưỡng Alicyclobacillus sẽ được phát hiện bằng đổ đĩa trực tiếp.

Xác định và nhận dạng

Sự phát triển của môi trường chọn lọc được xem là sự xác định có thể xuất hiện Alicyclobacillus, nhưng những nhận định từ các phép thử thông thường không đáng tin cậy. Một biện pháp thường được sử dụng chính là kiểm tra khuẩn lạc trong cơ chất guaiacol bởi vì đặc trưng của chất gây mất hương vị do khuẩn A. terrestris nằm ở chỗ nó là chất hữu cơ. Phương pháp này dựa trên sự sản sinh guaiacol từ vanilin sau khi ủ trong môi trường lỏng và phát hiện bởi phép thử đo màu enzyme (peroxidase enzyme colourimetric assay - PECA). Quy trình này sẽ cho ra một hỗn hợp màu nâu trong môi trường. A. acidoterrestris có thể được phân biệt rõ ràng với A. acidocaldarius bằng cách nuôi cấy ủ tại các mức nhiệt độ 30, 45 và 60oC. A. acidoterrestris không phát triển ở nhiệt độ 65oC và A.acidocaldarius là 30oC.

Những phương pháp nhanh

Các phương pháp nuôi cấy thông thường có thể mất từ 10 – 12 ngày để phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn Alicyclobacillus trong các và hơn 24 giờ đồng hồ để xác minh sự sản sinh guaiacol bằng cách phân lập. Quá trình phân lập thậm chí còn tốn thời gian hơn. Vì vậy những nỗ lực nghiên cứu đang hướng vào việc tối giản thời gian truy xuất kết quả. Một số công nghệ cho kết quả nhanh đã được tiến hành, trong số đó đã có những xét nghiệm được phát triển và áp dụng cho ngành công nghiệp sản xuất nước uống.

Nhận biết

Phân tích tế bào theo dòng chảy (flow cytometry) được áp dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp đồ uống để xác định tổng số lượng tế bào và phát hiện nấm men, tuy nhiên nó cũng được đầu tư nghiên cứu cho việc phát hiện Alicyclobacillus. Kỹ thuật này dựa trên phương pháp dán nhãn huỳnh quang cho các tế bào vi khuẩn, sau đó sẽ biến chúng thành mục tiêu có thể bị phát hiện dưới ánh đèn laser. Phân tích tế bào theo dòng chảy không thực sự nhạy bén và còn yêu cầu ít nhất 103 đơn vị tế bào/ml thì mới có thể truy xuất kết quả. Điều này đồng nghĩa với việc sẽ vẫn cần cung cấp quỹ thời gian dùng cho quá trình tiền ươm tạo hoặc tăng sinh nhưng quá trình này sẽ được cắt giảm từ 3–5 ngày xuống còn khoảng 10 giờ đồng hồ. Các phương pháp sinh học phân tử cũng được nghiên cứu phát triển để phát hiện nhanh Alicyclobacillus. Phương pháp phát hiện dựa trên chuỗi trùng hợp (PCR) cũng được nghiên cứu rộng rãi và ít nhất một bộ công cụ thử nghiệm cũng trở nên khả dụng. Tập đoàn Merck Millipore đã phát triển một bộ công cụ thử nghiệm có thể phối hợp cùng bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu nhằm mục đích phát hiện sự có mặt của Alicyclobacillus dựa trên PCR thời gian thực. Số lượng tế bào tối thiểu cần cho việc phát hiện là khoảng 100 tế bàoị/ml. Phương pháp này không có khả năng phát hiện ra những bào tử, cho nên vẫn sẽ cần đến giai đoạn tiền ươm tạo và tăng sinh để cho phép các phân tử và tế bào sinh dưỡng sinh sôi trong 48 tiếng thay vì từ 5-7 ngày. Quá trình phát hiện sẽ tốn khoảng vài giờ đồng hồ và bộ công cụ thử nghiệm này có thể xác định A. acidoterrestris. Bên cạnh đó, công nghệ dò đoạn gen (Gene probe technology) cũng được áp dụng trong việc phát hiện Alicyclobacillus và được phát triển thành một bộ sản phẩm thương mại dưới cái tên Vermicon VIT-Alicyclobacillus. Phương pháp kiểm tra có thể được áp dụng trực tiếp vào nuôi cấy tăng sinh và bản thân mẫu thử sau quãng thời gian tiền ươm tạo ngắn (48 tiếng) mà không cần tách chiết ADN. Biện pháp này sử dụng công nghệ dán nhãn huỳnh quang cho các chuỗi gen liên kết với phân tử rRNA trong các tế bào vi khuẩn trong thời gian ủ ngắn. Các mẫu sau đó sẽ được quan sát dưới kính hiển vi nhằm phát hiện và phân biệt sự xuất hiện của các loại Alicyclobacillus và A. acidoterrestris. Kết quả xét nghiệm được đưa ra trong 3 giờ đồng hồ.

Nhận dạng

Khó khăn trong việc xác nhận những dấu hiệu của Alicyclobacillus trong mẫu thử và xác định phân lập bằng các kỹ thuật thử nghiệm dẫn đến việc phải có những phương án thay thế. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) được sử dụng để phân tích thành phần của thành tế bào vi khuẩn và màng lưới. Phương pháp này cho thấy rõ sự phù hợp trong việc phân loại Alicyclobacillus và những vi khuẩn khác trong quá trình nuôi cấy. FT-IR cũng có khả năng phân biệt sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn A. acidoterrestris khác nhau và nhận dạng sử sản sinh cơ chất guaiacol. Các phương pháp phân tử cũng cho thấy những hứa hẹn trong việc nhận diện các loại vi khuẩn thuộc Alicyclobacillus. Giải trình tự ADN cũng cho thấy công dụng của mình và những ưu việt về tốc độ trong công nghệ giải trình tự rất có thể sẽ tạo ra những phương pháp hiệu quả hơn mà không kém phần tiết kiệm. Các chip ADN mà trước đây được thiết kế để phân tích sự hoàn thiện của cấu trúc gen vi khuẩn giờ đây đã được phát triển và có khả năng nhận dạng không chỉ các chủng và loại vi khuẩn khác nhau mà còn cả những dấu hiệu của tính chất đặc trưng như là sự sản sinh cơ chất guaiacol.

Theo www.rapidmicrobiology.com

Tin bài khác